La mappatura ν-XRF a base di sincrotrone e la microscopia μ-FTIR consentono di esaminare il destino e gli effetti dei pigmenti del tatuaggio nella pelle umana.

Ines Schreiver ,Bernhard Hesse ,Christian Seim ,Hiram Castillo-Michel ,Julie Villanova ,Peter Laux ,Nadine Dreiack ,Randolf Penning ,Remi Tucoulou ,Marine Cotte &Andreas Luch

ASTRATTO

La prevalenza crescente dei tatuaggi provoca preoccupazioni di sicurezza rispetto alla distribuzione delle particelle e agli effetti all'interno del corpo umano. Abbiamo utilizzato tessuti cutanei e linfatici da cadaveri umani per affrontare la biochinetica locale mediante tecniche di XRF a livello di micro (μ) e nano (ν). Ulteriori metodologie avanzate basate sulla spettrometria di massa hanno permesso di dimostrare il trasporto simultaneo di pigmenti organici, metalli pesanti e diossido di titanio dalla pelle ai linfonodi regionali. Tra questi composti, i pigmenti organici mostrano la gamma di dimensioni più ampia con le specie più piccole preferenzialmente raggiungere i linfonodi. Utilizzando l'analisi μ-FTIR di sincrotrone siamo stati anche in grado di rilevare i cambiamenti ultrastrutturali del tessuto adiacente alle particelle del tatuaggio tramite alterazioni di proteina β-fogli di amido I a-elica e contenuto di lipidi elevati. Complessivamente segnaliamo forti evidenze sia per la migrazione che per la deposizione a lungo termine di elementi tossici e pigmenti tatuati, nonché per le alterazioni conformazionali delle biomolecole che probabilmente contribuiscono all'infiammazione cutanea e ad altre avversità sul tatuaggio.

 

INTRODUZIONE

Negli ultimi anni, la tendenza apparentemente inarrestabile per i tatuaggi ha messo in evidenza i problemi di sicurezza 1 . Attualmente, gli aspetti tossicologici di base, dalla biokinetica alle possibili alterazioni dei pigmenti, sono in gran parte incerte. Gli esperimenti animali che sarebbero necessari per affrontare questi problemi tossicologici sono stati valutati non etici perché i tatuaggi sono applicati come una scelta e mancano di una necessità medica, simile alla cosmetica 2 . Di conseguenza, i pericoli che potenzialmente derivano dai tatuaggi sono stati ancora studiati solo dall'analisi chimica degli inchiostri e dei loro prodotti di degradazione in vitro 3 , 4 , 5 , 6. Anche se i dati tossicologici potrebbero essere disponibili per alcuni ingredienti inchiostati individualmente, le informazioni sulle interazioni in vivo dei componenti dell'inchiostro e il loro destino all'interno del corpo sono rari.

 

I tatuaggi e il lavoro di trucco permanente depositano pigmenti insolubili nello strato della pelle cutanea (Fig.  1 ). In combinazione con tatuaggi, i linfonodi pigmentati e ingranditi sono stati notati in individui tatuati per decenni 7 . Dopo l'inserimento traumatico di inchiostri durante la procedura di tatuaggio, il corpo espellerà il maggior numero possibile di componenti attraverso l'epidermide danneggiata. Altri modi per pulire il sito di ingresso sono attraverso il trasporto attivo ai linfonodi mediante cellule fagocitizzanti o passivamente lungo i vasi linfatici 8 , 9 , 10 , 11 . Oltre alle osservazioni nell'uomo, uno studio in vivo nei topi ha rivelato i linfonodi colorati dopo il tatuaggio con un pigmento azo12 . Anche se questo non lascia dubbi sul fatto che il pigmento proviene da corrispondenti tatuaggi, l'origine e il destino dei pigmenti nei linfonodi umani non sono mai stati analizzati analiticamente finora. Ultimamente, l'unico studio che studia i linfonodi umani in individui tatuati ha valutato il suo contenuto sugli idrocarburi policiclici aromatici cancerogeni derivanti dalle particelle di carbonio 13 .

 

FIGURA 1

[caption id="attachment_4493" align="aligncenter" width="900"] Figura 1
Traslocazione delle particelle del tatuaggio dalla pelle ai linfonodi. Dopo l'iniezione di inchiostri per tatuaggi, le particelle possono essere trasportate passivamente attraverso sangue e fluidi linfatici o fagocitati da cellule immunitarie e successivamente depositate nei linfonodi regionali. Dopo la guarigione, le particelle sono presenti nel derma e nelle sinusoidi dei linfonodi drenanti. L'immagine è stata disegnata dagli autori (cioè CS).[/caption]

I pigmenti del tatuaggio sono costituiti da metalli colorati inorganici e dai suoi ossidi o da composti poliaromatici, tutti ritenuti biologicamente inerti. È quindi possibile prevedere una vasta gamma di elementi nel tessuto umano tatuato, tra i quali i sensibilizzatori di nichel (Ni), cromo (Cr), manganese (Mn) e cobalto (Co) contaminazione degli elementi 14 , 15 , 16 , 17 . Oltre al nero del carbonio, il secondo ingrediente più comune di inchiostri per tatuaggi è il biossido di titanio (TiO 2 ), un pigmento bianco normalmente applicato per creare certe tonalità quando mescolato con i coloranti. La tossicità di TiO 2dipende dalla sua speciazione (struttura cristallina) che può essere rutile o l'anatase 18 più fotocataliticamente attivo . Quest'ultima può portare alla formazione di specie reattive di ossigeno quando esposte alla luce solare. La guarigione ritardata è quindi spesso associata a tatuaggi bianchi, con elevazione e prurito della pelle 19 .

 

Il contributo degli inchiostri del tatuaggio al carico totale del corpo sugli elementi tossici, la speciazione di TiO 2 e le dimensioni e le dimensioni delle particelle di pigmento che migrano dagli strati della pelle subepidermica verso i linfonodi non sono mai stati analizzati analiticamente negli esseri umani prima. La dimensione media delle particelle in inchiostri del tatuaggio può variare da <100 nm a> 1 μm 20 . Quindi la maggior parte degli inchiostri del tatuaggio contengono almeno una piccola frazione di particelle nella gamma nano.

 

Qui abbiamo analizzato la pelle umana tatuata e linfonodi regionali provenienti da quattro donatori (corpi). La spettrometria di massa plasmatica (ICP-MS) accoppiata indottamente è stata utilizzata per valutare il contenuto generale degli elementi nei tessuti e negli inchiostri del tatuaggio dopo la digestione a microonde. Il tempo di volo di desorbimento / ionizzazione laser (LDI-ToF) ha facilitato l'identificazione dei pigmenti organici nei campioni enzimatici. Per individuare con precisione i diversi elementi nei microambienti cutanei e linfatici, per fornire informazioni su TiO 2speciation e per valutare la dimensione delle particelle primarie alla scala nanometrica in miscele di particelle, tuttavia sono state effettuate indagini di fluorescenza a raggi X a base di sincrotrone sia in ambito micro (μ-XRF) che nano (v-XRF). Inoltre, abbiamo valutato i cambiamenti biomolecolari nei rispettivi tessuti alla scala micrometrica e in prossimità delle particelle del tatuaggio usando spettroscopia a infrarossi (μ-FTIR) a trasformazione Fourier a base di sincrotrone.

 

RISULTATI

I pigmenti organici si traslocano dalla pelle ai linfonodi

Fornire prove analitiche di particelle del tatuaggio distribuite all'interno del corpo umano è stato un obiettivo fondamentale di questa indagine. A tal fine, sono stati analizzati campioni di tessuto di quattro individui tatuati con arancione, rosso, verde o nero e due donatori di controllo non tatuati per la presenza di pigmenti organici. La rilevazione delle stesse specie di pigmento sia nei linfonodi regionali sia in quelli della regione ha evidenziato il drenaggio delle particelle di tatuaggio in due dei quattro donatori tatuati (Fig.  2 ).

 

FIGURA 2

[caption id="attachment_4494" align="aligncenter" width="900"] Figura 2
I pigmenti organici si traslocano dalla pelle ai linfonodi. I pigmenti organici in pelle liscia e linfonodi sono stati identificati mediante LDI-ToF-MS. I campioni adiacenti della pelle e dei linfonodi (circa 5-10 mm) vengono visualizzati in criomagina dopo la preparazione di sezioni sottili per analisi μ-FTIR e μ-XRF. I campioni della pelle sono orientati con la sua superficie sul lato destro. I pigmenti organici identificati sono indicati sotto ogni campione. Le strutture chimiche dei pigmenti organici identificati nei campioni sono visualizzati sulla destra.[/caption]

L'identificazione dei pigmenti organici usando LDI-ToF-MS è stata descritta in gran parte con inchiostri 21 , 22 , 23 . Questa tecnica è basata principalmente sulle distribuzioni di isotopi e sulla massa molecolare (si veda la figura supplementare  S1 ). Nei tessuti lisci presentati qui, pigmenti coloranti sono stati trovati come ftalocyanine di rame con residui di idrogeno, cloro o bromo in tre su quattro campioni di pelle. Parti rossastre dei tatuaggi contenevano i pigmenti contenenti gruppi azoici 170 e arancio 13 (Fig.  2 ).

 

Per i donatori 1 e 2, l'assenza di pigmenti organici nei linfonodi suggerisce concentrazioni inferiori al limite di rilevazione (circa 0,1-1% w / w pigmento per estratto), possibile decomposizione metabolica o drenaggio ai linfonodi alternativi. La capacità generale per la traslocazione del pigmento di azo nei linfonodi è stata dimostrata nei campioni aggiuntivi di pelle e linfonodi del donatore 2 (Tabella supplementare  1 ). D'altro canto, le particelle di carbonio nere eventualmente responsabili del colore nero della pelle e dei linfonodi (Fig.  2 ) non erano accessibili con i metodi analitici utilizzati in questa indagine. Non sono state rilevate particelle di pigmento xenobiotico nei tessuti della pelle o del linfometro dei campioni di controllo.

 

I tatuaggi contribuiscono al carico elementare dei linfonodi

Un obiettivo centrale di questo studio era quello di valutare in che misura il tatuaggio aumenta la percentuale di elementi tossici nell'organismo. Abbiamo individuato quantitativamente elevati livelli di Al, Cr, Fe, Ni e Cu nei campioni di cute e linfonodi utilizzando l'analisi ICP-MS (Tabella  1 e Tabella Supplementare  S2 ). Per il donatore 4, le concentrazioni di Cd e Hg sono state riscontrate solo nei linfonodi, ma non nelle sezioni di pelle analizzate. Questi elementi probabilmente derivano da altri tatuaggi che non fossero parte di questo studio o altri percorsi di esposizione drenati attraverso lo stesso tessuto linfatico. La valutazione non-quantitativa delle scansioni di indagine ha rivelato la presenza di Ti, presumibilmente derivata da TiO 2 , in tutti i campioni di pelle tatuati ma non nei controlli.

 

TABELLA 1: concentrazioni di elementi per peso (ppm) di tessuto nei campioni di pelle umana e linfonodali analizzati da ICP-MS.

[caption id="attachment_4495" align="aligncenter" width="823"] Tabella di formato completo
La digestione a microonde usata in questa indagine non è idonea a dissolvere completamente Fe e Ti, anche se non sono visibili particelle residue. Quindi le concentrazioni di Fe potrebbero non rappresentare la quantità totale dei campioni, ma consentono la distinzione tra concentrazioni fisiologiche nei controlli e nei campioni contenenti Fe estrinseca. I livelli elevati di Fe presenti nella pelle e nei linfonodi del donatore 4 implicano un ulteriore utilizzo di pigmenti a base di ferro. Nei donatori 1, 2 e 3, le concentrazioni di Fe sono state aumentate solo nei linfonodi adiacenti e non nei corrispondenti campioni di pelle (Tabella  1 ). Le concentrazioni di Fe possono anche essere influenzate da sangue residuo all'interno dei campioni di tessuto.[/caption]

 

Nel donatore 4, l'uso di pigmento di rame di ftalosianina verde 36, identificato con LDI-ToF-MS, è riflesso da elevate quantità di Cu in pelle e linfonodi, nonché il rilevamento non quantitativo di Br (Tabella  1 ). Al contrario, sebbene il pigmento di rame di phthalocyanine verde 7 fosse ben rilevabile con il nostro approccio LDI-ToF-MS nella pelle del donatore 2, non era nel corrispondente linfonodo regionale. I livelli di Cu aumentati misurati da ICP-MS in questo campione adiacente, tuttavia, suggeriscono la presenza di questo pigmento di phthalocyanine di rame. Alla luce delle altre due ftalocyanine di rame applicate nei livelli di donatore 2 (verde 7) e 3 (blu 15), elevati livelli di Cu in pelle sono venuti senza sorpresa (Tabella  1). Nel donatore 2, i livelli di Cu nei linfonodi sono fortemente aumentati nonostante il fatto che il verde 7 non sia stato rilevato con LDI-ToF-MS. Tuttavia, sono stati utilizzati campioni adiacenti di tessuto per ogni analisi. Data la natura dei campioni, la deposizione di pigmenti nella pelle e nei linfonodi non è omogenea e quindi spiega i diversi risultati. È interessante notare che il donatore 1 di controllo non tatuato ha avuto anche leggermente elevati livelli di circa 13 ppm Cu nei linfonodi, che è ancora nell'intervallo della media di 5,89 ± 8,03 ppm di Cu rilevabile nei linfonodi di cadaveri femminili (Tabella  1 ) 24 .

 

Inoltre, Ni e Cr sono stati trovati negli esemplari umani. Poiché i livelli di Ni sono stati aumentati nella pelle e nei linfonodi del donatore 2 e 3, la fonte probabile è il tatuaggio. In diversi studi, entrambi gli elementi sono stati legati a reazioni avverse che si verificano nei pazienti tatuati 25 , 26 , 27 , 28 . Ni e Cr sono noti per essere allergenici e cancerogeni. Le concentrazioni di 0,28-10,05 ppm del peso totale del tessuto trovato qui si trovano nell'intervallo di 0,8-3,7 ppm di peso secco Ni nei linfonodi hilar nei precedenti studi 29 . Il CD è stato drasticamente elevato solo nel linfonodo del donatore 4. Per tutti gli altri campioni, i tessuti tissutali Cd si trovano nei valori normali 24 .

 

Infine, Al era presente anche nei tessuti della pelle e del linfonodo dei tre donatori tatuati 2, 3 e 4 (Tabella  1 ). Poiché i linfonodi ausiliari sono stati studiati nel caso dei donatori 2 e 3, non è possibile escludere la coesposizione da antiperspiranti contenenti vari sali di alluminio, né nei campioni tatuati né nei controlli. Tuttavia, le concentrazioni di Al nei controlli erano inferiori. Il metallo leggero Al ha recentemente attirato l'attenzione a causa del suo accumulo nel tessuto tumorale del seno 30 . Mentre il suo ruolo nell'emergenza della neoplasia è attualmente molto contestato, il suo contributo al verificarsi di granulomi di ipersensibilità associati ai tatuaggi è stato dimostrato da decenni 31 .

 

La mappatura μ-XRF collega gli elementi metallici alle particelle del tatuaggio

Per collegare gli elementi trovati con ICP-MS in particelle di pigmento del tatuaggio e per localizzarli all'interno dei tessuti, è stata eseguita l'imaging μ-XRF con sonde sub micrometriche sulle sezioni di pelle e linfonodi (Fig.  3a-d ). La posizione delle particelle può essere alterata dalla preparazione del campione. Poiché le sezioni trasversali sono state fatte spostando il coltello parallelo alla superficie della pelle, il profilo di profondità dei pigmenti dovrebbe rimanere inalterato. Le sezioni sottili della pelle e dei linfonodi dai donatori 1, 3 e 4 sono state analizzate all'ESRF beamline ID21, con un'energia emozionante di 5,05 keV (Fig.  3a-d e Supplementary Fig.  S2 ). Poiché le sezioni sottili sono state depositate su BaF 2finestre per ulteriori analisi μ-FTIR, l'energia è stata scelta per evitare l'eccitazione di linee Ba ​​L (<5,24 keV). I risultati del donatore 4 sono riportati in Figura  3 come esempio.

 

FIGURA 3

[caption id="attachment_4496" align="aligncenter" width="900"] Figura 3
La mappatura μ-XRF identifica e individua gli elementi di particelle del tatuaggio nelle sezioni del tessuto linfonodale e linfonodale. Le sezioni del tessuto della pelle e del linfonodo del donatore 4 sono state analizzate mediante sincrotrone μ-XRF. ( a ) Le immagini visive microscopiche (VLM) dell'area mappata da μ-XRF. I pigmenti del tatuaggio sono indicati da una freccia rossa. ( b ) la colorazione DAPI delle sezioni adiacenti che mostrano i nuclei delle cellule. ( c ) mappe μ-XRF di P, Ti, Cl e / o Br. Per il linfonodo, aree di dimensioni simili sono contrassegnate in ( a ) e ( b ). ( d ) Spettri μ-XRF medi su tutta la superficie visualizzata in picco di diffrazione ( c ) * dal supporto del campione; ** picco di spargimento del fascio in arrivo. ( e) Spettri μ-XANES di Ti K-edge di pelle e linfonodi rispetto allo spettro XANES di trasmissione del materiale di riferimento di rutile, anatasi e un calcolo di miscela di rutile / anatasi 80/20.[/caption]

 

La maggior parte delle particelle nel tessuto cutaneo è stata circondata da nuclei ricchi di fosforo visualizzati mediante la colorazione DAPI in microscopia a fluorescenza (Fig.  3b ) e l'integrazione dell'elemento P nell'analisi μ-XRF (Fig.  3c). È stato dimostrato in precedenza che le particelle del tatuaggio possono essere trovate principalmente intorno ai vasi 10 che potrebbero rappresentare l'elevata densità cellulare nel derma co-localizzato con i pigmenti.

 

Intensità di linee Ti K e linee Br L sono state estratte per mappare la distribuzione di TiO 2 e il verde fortemente legato al bromuro di phthalocyanine 36 (Fig.  3c ). Poiché le linee Br L si sovrappongono completamente alle linee Al K, entrambi possono contribuire all'intensità del picco. Tuttavia, l'analisi LDI-ToF-MS ha rivelato la presenza di verde verde 36 (Figura  2 ) ei risultati ottenuti da ID16B acquisiti a 17,5 keV, vale a dire sopra Br K-edge (13,47 keV) contributo (vedi figura supplementare  S3 ).

 

Le particelle del tatuaggio contenenti Ti e Br sono vicine tra loro con un leggero sovrapposizione nella pelle e sembrano essere più co-localizzate nel tessuto linfatico (Fig.  3c ). Entrambi gli elementi sono stati trovati nel derma del donatore 4 direttamente sotto l'epidermide ricca di cellule nucleari e fino a poche centinaia di micrometri profondi nella pelle. Nei linfonodi, alcune particelle sono state depositate nello stroma direttamente sotto la capsula. La maggior parte delle particelle contenenti Ti e Br, tuttavia, è diventata visibile come agglomerati di pigmento ad una distanza di circa 250 μm alla capsula linfonodale. Al contrario, le concentrazioni di Cl sono più alte nella capsula del linfonodo e le concentrazioni inferiori si trovano nella regione delle particelle come parte del pigmento verde di phthalocyanine 36.

 

Tutti i campioni analizzati dai donatori tatuati contenevano Ti. È improbabile che altre fonti, ad esempio schermi solari, spiegano gli alti importi rilevati in questa indagine. Alti livelli di Ti sono attesi solo nei linfonodi polmonari e hilar da esposizione respiratoria 32 . Altri elementi altamente abbondanti sono K e Ca come sono fisiologicamente presenti nelle cellule (Fig.  3d ).

 

Abbiamo anche indagato se il Ti presente è il pigmento bianco TiO 2 atteso e se i rutili stabili e / o le fasi cristalline di anatasi più fotoreattive sono state usate negli inchiostri del tatuaggio. Lo spettro del donatore 4 ha mostrato una correlazione più qualitativa con lo spettro di riferimento di microscopia a raggi X vicino ai bordi della struttura del bordo (μ-XANES) al Ti K-edge per la pelle ei linfonodi dei donatori 1, rutile rispetto a quello di anatase (Fig.  3e). Un chiaro interruttore dei picchi di picco tra 4.99-5 keV si verifica come differenza di entrambi i tipi di strutture di cristallo. Uno spettro calcolato di 20% di anatasi e 80% di miscela di rutile non è chiaramente distinto dal rutile puro, ma mostra un pre-bordo a circa 4,97 keV, simile agli spettri μ-XANES dei campioni tattooati. Pertanto, per lo più rutile TiO 2 è presente in tutti i donatori tatuati, con minori quantità di anatasi (Fig.  3e e Fig. S2 supplementari  ).

 

La dimensione delle particelle varia tra le specie di pigmento

Le mappe μ-XRF ottenute nelle sezioni della pelle e del linfonodo mostrano grandi agglomerati di particelle di tatuaggio fino a diversi micrometri (Fig.  3c ). Tuttavia, è noto che le particelle di piccole dimensioni sono trasferite preferenzialmente ai linfonodi. La dimensione del fascio da 0,3 × 0,7 μm² per la mappatura μ-XRF all'ID21 era quindi un fattore limitante per la determinazione delle dimensioni delle particelle. Per valutare le dimensioni delle particelle primarie, abbiamo inoltre effettuato le indagini ν-XRF applicando un fascio di 50 × 50 nm² a 17,5 keV per eccitare le linee Br K. Gli esperimenti sono stati effettuati in sezioni adiacenti di pelle e linfonodi dal donatore 4, preparati su fogli ultraleggeri (Figura  4 ). Abbiamo individuato tre differenti particelle di pigmento, ognuna delle quali presenta una diversa composizione elementale e distribuzione all'interno della stessa area (Fig. 4b, e ). La dimensione media delle particelle di TiO 2 in entrambi i nodi pelle e linfonodi era 180 nm con una deviazione standard di 23 nm e un errore standard di 7 nm. Quindi questa dimensione particellare di grandi dimensioni non impedisce la distribuzione attraverso il fluido linfatico.

 

FIGURA 4

[caption id="attachment_4497" align="aligncenter" width="900"] Figura 4
Mappatura delle particelle e distribuzione delle dimensioni dei differenti elementi del pigmento del tatuaggio. La pelle e il linfonodo del donatore 4 sono stati analizzati mediante sincrotrone ν-XRF. ( a , d ) Ti e il fosfato contenente il pigmento verde 36 sono situati uno accanto all'altro. Spettri XRF medi su tutta la superficie visualizzata nelle regioni di interesse rivelano la presenza di Br, Si, S, Cl, Ca, Ti, Cr, Fe, Ni, Cu e Zn. ( b , e ) Le mappature di scala di log di Ti, Br e Fe nelle stesse aree indicate in ( a) e ( d ) mostrano dimensioni primarie di particelle di pigmenti diversi. ( c , f ) Ingrandimenti delle aree indicate in ( b ) e ( e) rispettivamente.[/caption]

 

Al contrario, il verde di phthalocyanine pigmentato 36 analizzato con ν-XRF mappatura di Br era molto più polidisperso, con particelle presumibilmente minori della risoluzione di 50 nm e fino alla gamma μm nella pelle. Nel tessuto linfonodale, le particelle contenenti Br erano più piccole, con meno particelle di dimensioni maggiori (Fig.  4c, f ). Da ciò si può supporre che il trasporto di particelle più piccole sia preferenziale.

 

Con l'energia scelta, Br può essere identificata in modo inequivocabile dalla sua emissione di linee K. La pelle e il linfonodo del donatore 4 contenevano anche Cu, correlati ai pigmenti di phthalocyanine rame identificati, e le sue mappe mostrano una perfetta co-localizzazione con Br (vedere la figura supplementare  S3 ). Inoltre, le particelle di Fe erano presenti nel linfonodo, ma non in tessuto cutaneo e quindi probabilmente derivano da un altro tatuaggio o da un percorso di esposizione (Fig.  4c, f e Figura S3 supplementare  ).

 

Le particelle del tatuaggio inducono cambiamenti biomolecolari

La stazione terminale μ-FTIR a base di sincrotrone a ID21 è stata utilizzata per monitorare i cambiamenti nella conformazione proteica e nel contenuto proteico e lipidico in prossimità delle particelle del tatuaggio. Le analisi di Synchrotron μ-FTIR permettono l'ipotesi che i pigmenti del tatuaggio si trovino in un ambiente proteico β-fogliare ricco di lipidi.

 

Le stesse sezioni studiate tramite μ-XRF a ID21 sono state analizzate mediante μ-FTIR, prima delle analisi radiografiche, per facilitare la corrispondenza esatta del sito (cfr. Figure  3 e 5 ). Pertanto, i risultati di μ-FTIR non sono stati alterati dalla radiazione μ-XRF delle sezioni del tessuto. L'elevato flusso fotonico di sincrotrone ha permesso un'elevata risoluzione spaziale. Di conseguenza, le dimensioni del fascio e dei pixel sono state ridotte rispettivamente a 10 × 10 μm² e 8 × 8 μm². Questa risoluzione è sufficiente a distinguere il derma regolare dai pigmenti che contengono le aree del derma, ma rimane insufficiente per separare in modo inequivocabile lo strato corneodall'epidermide, che sono stati analizzati qui come un singolo dominio (vedi sotto). Variazioni spettrali specifiche relative alla modifica della composizione e alla conformazione della biomolecola vengono visualizzate usando il donatore 4 come esempio, sulla base di due mappe μ-FTIR ottenute in una singola sezione in due posizioni diverse per il linfonodo regione cutanea e cutanea (Fig.  5 ). La banda di assorbimento che raggiunge i 2920 cm -1 corrisponde alla modalità di stretching - CH 2 , che è molto più intenso nei lipidi che nelle proteine. Può essere utilizzato per mappare qualitativamente la distribuzione dei lipidi su sezioni sottili (Fig.  5a ). Esso mostra un'intensità maggiore nello strato corneo , come previsto 33. Queste mappe presentano anche qualitativamente una maggiore intensità nelle aree del derma contenente pigmenti di tatuaggio rispetto alle regioni di controllo prive di pigmenti. Sulla base delle immagini microscopiche e delle mappe μ-XRF descritte in precedenza, tre aree sono state selezionate su ciascuna mappa. Per la sezione cutanea abbiamo diviso la mappatura ottenuta in strato corneo e epidermide (SC), derma senza pigmento (D) e derma intorno a particelle di pigmento (DP) (Fig.  5a ). La Spectra nel secondo derivato di queste aree è stata analizzata statisticamente mediante il Principal Component Analysis (PCA). La distribuzione dei punti lungo l'asse PC-1 conferma che D e DP hanno meno catene alchiliche legate al lipidico ( - modalità di estensione CH 2 , assimilazione a 2920 cm -1 e- CH 2 sym. a 2854 cm -1 ) ed estere ( - C = O stretching mode, picco a 1745 cm -1 ), e che le regioni DP contengono livelli più alti di lipidi rispetto a D (Fig.  5b-d ). PC-2 separa DP da D e SC poiché questi ultimi due hanno concentrazioni superiori di proteine.

 

FIGURA 5

[caption id="attachment_4498" align="aligncenter" width="900"] Figura 5
Cambiamenti della composizione e della struttura biologica nella vicinanza cellulare delle particelle di pigmento del tatuaggio. Sezione del donatore 4 analizzato mediante sincrotrone μ-FTIR a ID21, ESRF. ( A , e ) Mappa in derivata seconda ottenuti a 2920 cm -1 (-CH 2 vibrazioni asimmetriche) di due zone diverse sia nel nodo pelle o linfa donatore 4 in sovrapposizione un'immagine al microscopio ottico visibile. I singoli punti per l'analisi PCA in ( c ) e ( g ) sono stati prelevati dalle aree indicate. ( b , f ) Spettri medi di ciascuna regione segnata in ( a , e ) in secondo derivato. ( c , g) PCA punteggio di PC-1 vs PC-2. ( d , h ) Parti di caricamento di PC-1 e PC-2. Abbreviazioni: SC =  stratum corneum e epidermide; D = derma; DP = derma con particelle; P1, P2 = regioni contenenti particelle; C1, C2 = regioni di controllo senza particelle.[/caption]

 

Oltre a determinare la distribuzione del componente, μ-FTIR può essere utilizzato per identificare e mappare le strutture secondarie proteiche attraverso le sezioni della pelle 33 . Nell'epidermide, i cheratinociti differenziano per formare finalmente il corneo strato ricco di proteine ​​e lipidi . Nell'area SC della nostra ricerca - che comprende anche lo strato epidermico - il picco di amido I massimo a ~ 1655 cm -1 (Figura  5b ) deriva da α-eliche presenti nella cheratina 33 . Nel derma, il picco massimo situato a 1660 cm -1 corrisponde a tripliche eliche presenti nel collagene, mentre la spalla di β a 1635 cm -1 può essere assegnata a fibre collagene reticolate 33. In prossimità delle particelle di pigmento (DP), il contenuto proteico è più basso rispetto ad altre parti del derma ricco di collagene. Tuttavia, la spalla di β a 1635 cm -1 diventa più pronunciata vicino alle particelle (Fig.  5b ). Le vibrazioni - CH 2 e - C = O correlate ai lipidi sono anche più elevate in prossimità delle particelle rispetto ad altre parti del derma. Entrambi i risultati suggeriscono la presenza di proteine ​​ricche di proteine ​​denaturate e membrane lipidiche che circondano le particelle di pigmento. Altri studi hanno dimostrato che a contatto con superfici esteri, strutture proteiche possono essere alterate verso la formazione di beta-sheets 34. Nella pelle del donatore 2 è stato notato anche un contenuto lipidico similmente aumentato e la presenza di strutture a strato β nelle parti del derma intorno a particelle (vedere la figura supplementare  S4 ). Un confronto statistico di aree contenenti particelle e senza particelle nel tessuto linfonodale del donatore 4 ha mostrato un aumento simile del contenuto lipidico nell'ex (Fig.  5e-h ). Tuttavia, nessuna differenza consistente nel tipo di piegatura di proteine ​​potrebbe essere osservata nei linfonodi.

 

DISCUSSIONE

In questa ricerca abbiamo trovato un'ampia gamma di particelle di pigmento del tatuaggio con dimensioni fino a diversi micrometri nella pelle umana, ma solo le particelle più piccole (nano) trasportate nei linfonodi. Il limite di dimensione esatto che impedisce questa traslocazione non è ancora noto. Il deposito delle particelle porta ad un allargamento cronico del rispettivo linfonodo e all'esposizione permanente. Con la rilevazione degli stessi pigmenti organici e di TiO 2 inorganici nei linfonodi e nei linfonodi, forniamo forti analisi analitiche per la migrazione di pigmenti dalla pelle verso linfonodi regionali negli esseri umani. Finora, questo è stato ipotizzato solo in base a dati limitati da topi e osservazioni visive negli esseri umani 13 , 35. Siamo stati anche in grado di provare la presenza di diversi elementi tossici, come Cr e Ni, derivanti dal tatuaggio. Tuttavia, i depositi elementari nei linfonodi che non sono stati trovati nella pelle corrispondente hanno rivelato che il tatuaggio potrebbe non essere stato l'unico modo di esposizione in questi singoli individui i cui tessuti sono stati rimossi dopo la loro scomparsa.

 

È noto che i pigmenti risiedono nei lisosomi o rimangono attaccati alle membrane di fibroblasti dermiche 8 , 36 , un'osservazione che supporta i nostri risultati μ-FTIR di livelli lipidi concentrati in prossimità di particelle di pigmento. Le catene alchiliche lunghe ei gruppi esteri che abbiamo assegnato ai lipidi possono derivare anche da componenti di inchiostri per tatuaggi, ad esempio polimeri addensanti, tensioattivi e rivestimenti pigmentati. Tuttavia, i polietilen-glicol 37 e polimeri di polivinilpirrolidone al di sotto dei 20 kDa 38 sono spesso noti per essere metabolizzati e secreti. Inoltre, è stata dimostrata che la forte reazione di ossigeno e reattivo a base di ossigeno-driven di macrofagi rispetto al materiale estraneo altera anche il poliuretano altamente stabile 39. Riteniamo pertanto che questi additivi siano biodegradabili in vivo e quindi non siano più presenti nella pelle guarita tatuata. Poiché i rivestimenti iniziali e i tensioattivi delle particelle erano sconosciuti, le interferenze in μ-FTIR non possono essere completamente escluse però.

 

Nei casi in cui viene introdotto materiale idrofobo straniero nel corpo, probabilmente la fibrinogena e altre proteine ​​saranno adsorbite e denaturate alla sua superficie, portando così alla generazione e alla presentazione di materia pro-infiammatoria e al reclutamento successivo di cellule immunitarie come passo iniziale in la reazione del corpo estraneo innescato 40 , 41 . Questa assunzione è supportata dai nostri dati μ-FTIR sui cambiamenti conformazionali associati a proteine ​​della proteina β, in prossimità di pigmenti tatuaggio idrofobici e insolubili. Le reazioni del corpo estraneo sono note da iniezioni sottocutanee di TiO 2 42. Nonostante la natura idrofobica delle superfici di pigmento e la configurazione confermata della proteina β a questo punto confermata in prossimità dei pigmenti del tatuaggio nella pelle, la maggior parte degli individui tatuati, inclusi i donatori analizzati qui, non soffrono di infiammazioni croniche. Tuttavia, le reazioni granulomatiche di materiali estranei sono tra i principali effetti indesiderati non infettivi che si verificano durante il tatuaggio 43 . Fattori che impediscono la progressione verso reazioni avverse estranee del corpo in molti individui tatuati, nonostante la conformazione di β-fogli, devono essere ulteriormente studiati.

 

Negli esperimenti futuri esamineremo anche l'onere del pigmento e del metallo pesante di altri organi e tessuti interni più lontani per monitorare qualsiasi possibile biodistribuzione degli ingredienti di inchiostro del tatuaggio in tutto il corpo. L'esito di queste indagini non solo sarà utile nella valutazione dei rischi sanitari associati al tatuaggio ma anche nella valutazione di altre esposizioni come, ad esempio, l'ingresso di nanoparticelle TiO 2 presenti in cosmetici nel sito della pelle danneggiata.

 

METODI

Preparazione del campione umano

Campioni di pelle tatuata e linfonodi regionali, nonché campioni di linfonodi e linfonodi di due donatori aggiuntivi senza tatuaggi sono stati presi postmortem presso l'Istituto di Medicina Forense presso l'Università di Ludwig-Maximilians di Monaco (autopsia ordinata dal tribunale senza ulteriori compromessi cosmetici alla pelle). Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo la Dichiarazione di Helsinki del 1975. Tutti i campioni sono stati ottenuti in forma anonima senza informazioni sullo stato di malattia, sulle cause di morte o sulle demografie. L'approvazione etica dei campioni di biopsia umana è stata concessa dal comitato etico della Facoltà di Medicina dell'Università Ludwig-Maximilians di Monaco. Abbiamo selezionato campioni con tatuaggi diversi dal nero e che sono più probabili a contenere TiO 2e pigmenti organici. La dimensione del campione è stata limitata dalla disponibilità di esemplari e dal tempo di trasmissione a ESRF. I campioni di tessuti sono stati immagazzinati in sacchetti di plastica a -20 ° C direttamente dopo l'escissione e successivamente elaborati per analisi entro un anno. I sottotrattini sono stati tagliati utilizzando un bisturi standard e congelati nella matrice TissueTek OCT (Sakura Finetek, Staufen, Germania) per la sezione di cri-microtomi. Le sezioni di 5 o 6 μm sono state ottenute e montate su substrati BaF 2 (Crystal GmbH, Berlino, Germania) per misure μ-FTIR e μ-XRF a ID21. Le sezioni per microscopia leggera a fluorescenza avevano uno spessore di 6-10 μm e sono state depositate su diapositive standard di vetro, mentre le analisi ν-XRF all'ID16B sono state eseguite su sezioni di 12-14 μm su pellicole Ultralene da 4 μm (Spex Sample Prep, Metuchen, NJ , Stati Uniti) montati su Si 3 N4 finestre. Le sezioni sono state inattivate usando il 4% di tampone di formaldeide per 10 minuti e successivamente lavate con acqua deionizzata (2 volte, 2-5 min). Per le analisi μ-FTIR e μ-XRF, i campioni sono stati congelati e conservati in un ambiente disidratato. Le sezioni sulle vetrini microscopiche sono state montate in DAPI-Fluoromount G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) per la colorazione del nucleo cellulare.

 

Analisi ICP-MS

Sono state analizzate composizioni elementari di un totale di 20 skin e 25 campioni di linfonodi di donatori tatuati, nonché 2 campioni di pelle e 2 linfonodi di donatori non tatuati utilizzando una digestione a microonde con acido nitrico (Ultraclave, MLS, Leutkirch, Germania). I campioni erano direttamente adiacenti a quelli utilizzati in altre parti in questa ricerca. Cinque millilitri di acido nitrico al 69% sono stati aggiunti a campioni di tessuti da 50-200 mg in recipienti in teflon e riscaldati nel forno a microonde con le seguenti fasi: 20-80 ° C (3,5 min, 100 bar, 700 W); 80-130 ° C (10 min, 120 bar, 1000 W); 130-200 ° C (6,5 min, 150 bar, 1000 W), 200 ° C (30 min, 150 bar, 1000 W). Le concentrazioni elementali indicate in ppm sono calcolate in relazione al peso del tessuto digerito. L'acido nitrico è stato purificato utilizzando un sistema di distillazione sub-bollente al quarzo duoPUR (MLS, Leutkirch, Germania). L'acqua ultrapure è stata ottenuta utilizzando un sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q Advantage A10 equipaggiato con un'unità Millipore Q-POD (entrambi da Merck, Darmstadt, Germania). Le norme per l'ICP sono state acquistate da Sigma Aldrich (Monaco, Germania, vale a dire Sc, Al, Cu, Ni, Hg) o Merck (Darmstadt, Germania) nel caso di In. Per Cr, Fe e Cd 1000 mg / l soluzioni standard in acido nitrico diluito sono state ottenute da VWR (Darmstadt, Germania).

 

Una diluizione di 20 volte di ogni campione è stata preparata, compresi 10 ppb degli elementi In e Sc come standard interni. Per l'analisi del campione sono stati utilizzati XSeries II ICP-MS (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Germania) e un campionatore automatico ESI SC2 (Elemental Service & Instruments, Mainz, Germania). L'analisi del campione è stata effettuata in triplice copia con 100 spazzamenti ciascuno. La risoluzione è stata impostata a 0,02 amu e il tempo di sosta per tutti gli elementi è stato di 10 ms. Le misurazioni sono state eseguite con una cella di collisione in modalità -3,0 V (In, Sc, Cr, Fe, Ni, Cu, Cd) o 0,0 V (Sc, Al). H 2 / He (7% v / v) è stato utilizzato come gas di collisione con portata di 5 ml / min. I dati sono stati elaborati con PlasmaLab 2.5.11.321 (Thermo Scientific, Bremen, Germania).

 

Identificazione LDI-ToF-MS di pigmenti organici

In totale sono stati analizzati 8 campioni di pelle e 8 linfonodi di donatori tatuati, nonché 2 campioni di pelle e 2 linfonodi di donatori non tatuati. Campioni tra 50-200 μg sono stati lisati usando collagenasi da 1 mg / ml di Clostridium histolyticumTipo IA (Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania) con un tempo di incubazione di almeno 24 ore a 37 ° C. I lisati sono stati inattivati ​​termicamente a 90-95 ° C per almeno 12 ore. Le particelle pigmentate precipitate sono state lavate due volte con PBS. La centrifugazione è stata effettuata con 500 g per 10 min. I precipitati sono stati applicati come film sottili ad una piastra di riferimento in acciaio macinato con una punta di pipetta di plastica e misurata con un UltrafleXtreme MALDI-ToF / ToF (Bruker Daltonik, Bremen, Germania). Spettri sono stati ottenuti mediando 3000 spettri individuali, con una velocità laser di 1000 Hz in modalità di riflettore positivo. Lo strumento è stato calibrato prima di ogni misurazione con un kit di calibrazione MALDI ProteoMass ™ esterno (Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania). I dati sono stati elaborati utilizzando il software flexControl 3.4 e flexAnalysis 3.4 (Bruker Daltonik, Bremen, Germania).

 

Microscopia FTIR di Synchrotron

Le analisi microscopiche FTIR sono state eseguite al beamline ID21 presso lo European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) di Grenoble, in Francia 44 . Il beamline è dotato di un microscopio Thermo Nicolet Continuum (Thermo Scientific, Madison, WT, USA) accoppiato ad uno spettrometro Thermo Nicolet Nexus FTIR (Thermo Scientific, Madison, WT, USA) con obiettivo a 32x, campione motorizzato e rivelatore HgCdTe a 50 μm raffreddato ad azoto liquido. Le mappe sono state acquisite in modalità di trasmissione utilizzando una trave di 10 × 10 μm², dimensione passo di 8 μm. La Spectra è stata registrata come una media di 64 scansioni per spettro, su un range di 4000 a 850 cm -1 e con una risoluzione spettrale di 4 cm -1 .

 

Il software OMNIC è stato utilizzato per trasformare spettri da mappe di campioni di pelle e linfonodi a secondi derivati ​​utilizzando Savitsky-Golay di secondo ordine polinomiale con 21 punti di lisciatura 45 , 46 . Il software Unscrambler X (versione 10.3, CAMO Software, Oslo, Norvegia) è stato utilizzato per ulteriori analisi statistiche. L'analisi dei componenti principali (PCA) è stata eseguita sui dati centrati a metà utilizzando le regioni spettrali da: 1800 a 1350 cm -1 (legate alle proteine) e da 3200 a 2800 cm -1 (legate ai lipidi) 47 , 48. PCA è stata eseguita separatamente per i campioni di pelle e linfonodi. Punteggio e tracciati di caricamento ottenuti con l'analisi PCA nonché valori medi delle regioni di interesse sono stati utilizzati per l'interpretazione dei dati.

 

Synchrotron μ-XRF e μ-XANES

Le analisi μ-XRF e μ-XANES sono state eseguite al raggio d'onda ID21 49 . Qui, i raggi X sono stati generati da un impulso U42 operato in modalità "gap-tracking", ossia il valore di gap è stato ottimizzato per ogni energia. Un monocromatico monocromatico Kohzu Si (111) è stato utilizzato in combinazione con uno specchio doppio piatto rivestito di Ni, che rifiuta armoniche ad alta energia e ha permesso la selezione energetica con una risoluzione di circa 0,4 eV della radiazione primaria a Ti K-edge (5.1 keV). A valle del monocromatore, il fascio fu concentrato fino a 0.4 × 0.8 μm 2 (verticale orizzontale orizzontale) utilizzando un sistema a specchio Kirkpatrick-Baez (KB) a curvatura fissa. Il flusso era di 1,6 × 10 10fotoni / s (~ 180 mA di corrente SR in modalità multicoppia). Un attenuatore Al 30 μm è stato utilizzato per ridurre il flusso fotonico di un ordine di grandezza per mantenere il tempo morto del rivelatore XRF all'interno della sua gamma lineare. Un fotodiodo che collega l'XRF da un sottile Si 3 N 4la membrana inserita nel percorso del fascio è stata utilizzata per monitorare continuamente l'intensità del fascio in arrivo. XRF e radiazioni disperse sono state raccolte con un rilevatore di deriva di silicio di energia dispersiva con un'area attiva di 80 mm² (Bruker Daltonik, Brema, Germania). Il tempo di acquisizione per punto è di 100 ms. Le dimensioni dei pixel per la raccolta delle mappe XRF sono state regolate alle regioni di interesse e variano da 0,5 μm a 5 μm. Le scansioni sono state eseguite in modalità continua (zap) e un'energia di 5,05 keV è stata selezionata per la mappatura μ-XRF. Per la raccolta di spettri Ti XANES, l'energia del fascio in entrata è stata scansionata da 4,95 a 5,1 keV in incrementi di 0,5 eV, con tempi di acquisizione di 100 ms per energia. A seconda della concentrazione della regione sperimentata, fra 1 e 10 μ-XANES spettri sono stati raccolti per punto e successivamente mediati.

 

Synchrotron ν-XRF

L'analisi su una sezione adiacente del tessuto della pelle e del linfonodo del donatore 4 è stata eseguita mediante ν-XRF a ID16B presso l'ESRF. La configurazione sperimentale è descritta altrove 50 . Un fascio rosa con un'energia di 17,5 keV con ΔE / E = 1% fu concentrato fino a 50 × 50 nm² usando gli specchi KB. Il flusso di> 1 × 10 11 fotoni / s è stato successivamente ridotto utilizzando attenuatori oro e silicio per mantenere il tempo morto sui rivelatori XRF nell'ambito della gamma lineare. Sono stati utilizzati due array di rivelatori di silicio a tre elementi (SGX Sensortech, Buckinghamshire, Regno Unito). Le due mappe ν-XRF sono state registrate con un passo di 50 × 50 nm² e 100 ms di tempo di permanenza. A differenza del set-up installato in ID21, l'ID16B funziona in aria. Per la stima della dimensione delle particelle di TiO 2, è stata eseguita un'analisi su 10 particelle, calcolando la larghezza totale a mezzo massimo di profili di linea attraverso le particelle.

 

Disponibilità di materiali e dati

I dati XRF e FTIR possono essere forniti dagli autori su richiesta individuale.

 

Omologazione etica dei campioni di biopsia umana

Campioni di pelle tatuata e linfonodi regionali sono stati presi postmortem e anonimo presso l'Istituto di Medicina Forense presso l'Università di Ludwig-Maximilians di Monaco nel quadro di autopsia ordinata dal tribunale senza informazioni sullo stato di malattia dei pazienti, cause di morte o demografie. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo la Dichiarazione di Helsinki del 1975 (vedi: http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/17c.pdf ). L'approvazione etica del recupero di biopsia umana è stata rilasciata dal comitato etico della Facoltà di Medicina dell'Università Ludwig-Maximilians di Monaco di Baviera, Germania (conferma da RP, membro del comitato etico).

 

INFORMAZIONI AGGIUNTIVE

Nota dell'editore: Springer Nature rimane neutrale per quanto riguarda le rivendicazioni giurisdizionali nelle mappe pubblicate e nelle affiliazioni istituzionali.

 

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Scarica i riferimenti

 

RINGRAZIAMENTI

Gli autori ringraziano l'ESRF per i beamtimes assegnati su ID21 e ID16B. N. Dommershausen è riconosciuto per l'aiuto tecnico con analisi LDI-ToF-MS. Siamo grati al Prof. Dr. Bäumler per le preziose discussioni. Questo lavoro è stato supportato dal progetto di ricerca intramurale (SFP # 1322-604) presso l'Istituto federale tedesco per la valutazione dei rischi (BfR).

 

INFORMAZIONI SULL'AUTORE

Note dell'autore

Ines Schreiver e Bernhard Hesse hanno contribuito allo stesso modo a questo lavoro.

affiliazioni

Istituto federale di valutazione dei rischi (BfR), Dipartimento di chimica e sicurezza dei prodotti, Max-Dohrn-Strasse 8-10, 10589, Berlino, Germania

Ines Schreiver, Peter Laux, Nadine Dreiack & Andreas Luch

European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), 38043, Grenoble, Cedex 9, Francia

Bernhard Hesse, Hiram Castillo-Michel, Julie Villanova, Remi Tucoulou & Marine Cotte

Physikalisch-Technische Bundesanstalt, Dipartimento di spettrometria a raggi X, Abbestrasse 2-12, 10587, Berlino, Germania

Christian Seim

Technische Universität Berlin, Istituto di Ottica e Fisica Atomica, Hardenbergstrasse 36, 10623, Berlino, Germania

Christian Seim

Istituto di Medicina Forense, Università Ludwig-Maximilians, Monaco di Baviera, Germania

Randolf Penning

CONTRIBUTI

AL, MC, RT e PL hanno progettato e supervisionato lo studio, compresa l'interpretazione di dati analitici. IS, BH, HC-M. e CS ha pianificato gli esperimenti. BH, HC-M, IS e CS eseguirono gli esperimenti all'ID21. JV ha eseguito gli esperimenti in ID16B. IS analizza i campioni mediante LDI-ToF-MS. IS e ND effettuano analisi ICP-MS. IS, BH, HC-M. e CS ha criticato criticamente i dati e redatto il manoscritto. CS ha progettato graficamente le figure. RP selezionato e fornito campioni umani adatti a questi esperimenti. AL e MC analizzarono i risultati complessivi e finalizzarono il manoscritto.

 

INTERESSI CONFLITTUALI

Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

 

autore Corrispondente

Corrispondenza a Andreas Luch .

 

Ricevuto: 15 marzo 2017

Accettato: 29 agosto 2017

Pubblicato online: 12 settembre 2017 sulla rivista scientifica Scientific Reports e online su Nature

Scientific Reports
TRUCCO PERMANENTE E TATUAGGIO - STUDI SCIENTIFICI